• 托夫生

       2023年4月25日美国FDA加速审批通过反义寡核苷酸药物Qalsody（Torfersen）用于治疗超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变所致肌萎缩侧索硬化（ALS）。ALS俗称“渐冻症”。Torfersen是FDA批准后第3个治疗ALS的药物，也是首款针对ALS的基因靶向疗法治疗药物。

Qalsody（Torfersen）

       关于反义寡核苷酸药物概念的提出，最早可以追溯到1967年。1967年前苏联科学院西伯利亚分院的Grineva等人提出设想，使用双氯乙胺、氮芥等烷化剂对互补核苷酸片断进行修饰，来调节目标基因。1977年，Grineva等人成功将化学修饰后的互补核苷酸片断，使缬氨酸tRNA发生烷基化。同年美国国家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI）的Paterson等人发现未经化学修饰的单链DNA，就能够使对应的RNA失去翻译功能。

       1978年美国亨廷顿纪念医院（Huntington Memorial Hospital）的Zamecnik和Stephenson利用含13个碱基的脱氧核糖核酸（DNA）片断，阻止了劳氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus）在鸡胚胎中的复制和细胞转化。他们也尝试对DNA片断的3ʹ端和5ʹ端进行化学修饰来阻止核酸酶（Nuclease）对DNA片断的降解。Zamecnik和Stephenson的努力，成功实现了反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASO）对于靶基因功能的干预，揭开了通过ASO特定序列调控目标基因的基因靶向疗法序幕。1979年，美国哈佛大学的 Donis-Keller 证实核糖核酸酶H（RNase H）能够选择性降解DNA-RNA复合双链中的RNA链，阐明了ASO清除目标RNA，调控靶基因功能的作用机制。

       一般把由12-28个碱基组成的核苷酸，称为寡核苷酸（Oligonucleotide，ON）。尽管反义寡核苷酸具有无限应用前景，但在80年代，3个实现问题限制了ASO的实际应用。第一、ON结构中磷酸核糖骨架的亲水性使ASO难以进入细胞；第二、ASO合成困难，自动合成ON所需的工艺和设备尚未开发出来；第三、对于人类基因的了解还十分有限。直到1998年，美国食品药品管理局（FDA）才批准了第一个ASO类药——福米韦生（Fomivirsen）。福米韦生为特殊序列的ASO使用硫代磷酸酯取代磷酸核糖骨架中磷酸酯，即将磷酸酯上的羟基（-OH）使用巯基（-SH）进行替代。硫代磷酸酯增加了ASO的脂溶性，使ASO更容易通过细胞膜。另外脂溶性增加后，也有助于ASO在血液中与血清蛋白可逆结合，延长作用时间。尽管硫代磷酸酯改善了分布和作用时间，但也会增加潜在的炎症反应。

使用硫代磷酸酯结构的ASO

       针对ASO磷酸核糖骨架中的核糖部分改造的策略，包括在核糖的2ʹ位引入2ʹ-MOE（2ʹ-OCH2CH2OCH3）取代基或将核糖的2ʹ位与4ʹ位进行环化。对核糖部分改造，一方面可以进一步改善ASO的亲脂性；另一方面可以使ASO耐受核酸酶的降解，并减少硫代磷酸酯引起的潜在炎症反应。尽管核糖2ʹ端的改造会影响RNase H降解ASO-RNA复合双链中的RNA链，但核糖2ʹ位改造的ASO依旧可以通过占位，调节目标基因发挥作用。由于RNase H需要至少5个连续的碱基序列，8-10个连续碱基序列可达到最佳活性，如需保留核糖2ʹ位改造的ASO对目标RNA的降解作用，可以通过混合排列的方式设计ASO，如使用8个连续不改变核糖2ʹ位的核酸片断作为中心区，两端分别引入多个使用核糖2ʹ位改造后的碱基序列。混排后，一方面进一步改善了ASO在体内的分布，减少硫代磷酸酯潜在的炎症反应，并可使ASO耐受核酸酶；另一方面，ASO-RNA复合双链中的RNA可以被RNase H降解，RNA降解后的ASO可以继续用于降解其它目标RNA。

使用硫代磷酸酯结构并对核糖2ʹ位改造的ASO

混合排列方式设计的ASO

       C9ORF72基因突变是引起家族性ALS的第一大常见原因，约占家族性ALS的25-40%的病例，全部ALS病例的6%。C9ORF72基因突变还会导致另一种神经退行性疾病，额颞叶痴呆（FTD）。约占FTD的25%。患者可能同时发生ALS和FTD，也有部分患者仅表现为ALS或FTD。关于C9ORF72基因突变后的对神经功能影响的机制，尚不完全清楚。

       SOD1基因突变是引起家族性ALS的第二大常见原因，约占家族性ALS的10-20%的病例，全部ALS病例的1-2%，目前已发现150多种SOD1基因突变。正常的SOD1有助于分解细胞内的毒性产物，从而避免破坏细胞。运动神经元和星形胶质细胞的SOD1突变基因，会形成在结构上出现错误的折叠SOD1蛋白，这类蛋白质可发生聚集。聚集物会进一步影响正常的细胞功能，并可能导致细胞内的其他蛋白质也发生错误折叠和聚集。

       尽管3期临床研究未能证明在Torfersen 在改善《ALS功能评分量表（ALSFRS-R）》评分方面优于安慰剂对照组。但基于Torfersen组脑脊液中SOD1蛋白和血液中神经损伤标志物神经丝蛋白轻链（NfL）下降水平显著优于安慰剂对照组，2023年4月25日美国FDA加速审批通过Biogen渤健的Qalsody（Torfersen）用于治疗SOD1基因突变所引起的家族性ALS。

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